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    技術文章

    通過棱光紫外可見分光光度計測量溶液吸光度的技巧

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       棱光紫外可見分光光度計是實驗室常用的分析儀器,而棱光(棱鏡/光柵型)分光光度計因其高精度和穩(wěn)定性,在科研、制藥、環(huán)境監(jiān)測等領域應用廣泛。然而,要獲得準確的吸光度數據,需要掌握正確的操作方法和優(yōu)化技巧。本文將詳細介紹使用它測量溶液吸光度的關鍵步驟和注意事項,幫助實驗人員提高測量精度。
     

     

      一、測量前的準備工作
     
      1.儀器預熱與校準
     
      -預熱時間:棱光分光光度計的光源(氘燈、鎢燈)和檢測器需要穩(wěn)定,通常開機后預熱15-30分鐘,確保基線平穩(wěn)。
     
      -基線校正:使用空白溶劑(如純水或緩沖液)進行基線掃描,扣除背景干擾。
     
      -波長校準:使用標準濾光片(如鈥玻璃)檢查波長準確性,確保儀器光學系統(tǒng)正常。
     
      2.樣品處理
     
      -選擇合適的溶劑:確保溶劑在測量波長范圍內無吸收(如測定DNA時避免使用在260nm有吸收的Tris緩沖液)。
     
      -樣品濃度優(yōu)化:吸光度(A)應在0.1-1.0之間(符合比爾定律線性范圍),過高需稀釋,過低可增加光程(如使用10mm比色皿改為20mm)。
     
      -過濾或離心:若樣品渾濁或有顆粒,需用0.22μm濾膜過濾或離心,避免光散射干擾。
     
      二、測量過程中的關鍵技巧
     
      1.比色皿的正確使用
     
      -材質選擇:
     
      -石英比色皿:適用于紫外區(qū)(190-350nm),不可用于強酸/強堿。
     
      -玻璃比色皿:僅適用于可見光區(qū)(350-800nm),成本較低。
     
      -清潔與放置:
     
      -使用前后用溶劑(如乙醇)清洗,避免指紋或殘留影響透光率。
     
      -放入樣品池時,確保光面(磨砂面為手持面)對準光路,避免角度偏差。
     
      2.參數優(yōu)化
     
      -狹縫寬度:
     
      -狹縫越窄,分辨率越高,但光通量降低,信噪比下降。通常選擇1-2nm平衡靈敏度和分辨率。
     
      -掃描速度:
     
      -快速掃描(如1200nm/min)適合初步篩查,慢速掃描(如60nm/min)可提高數據精度。
     
      -積分時間:
     
      -低濃度樣品可適當延長積分時間(如0.5-1秒),提高信號穩(wěn)定性。
     
      3.避免常見誤差來源
     
      -雜散光干擾:
     
      -高濃度樣品(A>2.0)易受雜散光影響,需稀釋后測量。
     
      -溶劑揮發(fā):
     
      -揮發(fā)性溶劑(如甲醇)需加蓋測量,或使用帶蓋比色皿。
     
      -溫度影響:
     
      -溫度敏感樣品(如酶反應體系)建議使用恒溫比色皿架。
     
      三、數據后處理與驗證
     
      1.基線扣除
     
      -若空白溶劑與樣品基質不同(如含蛋白質的緩沖液),需使用相同基質的空白校正。
     
      2.多波長測量
     
      -對復雜體系(如混合物),可掃描全波段(如200-800nm),結合導數光譜或峰擬合提高分析準確性。
     
      3.重復性與統(tǒng)計
     
      -每個樣品至少測3次,計算相對標準偏差(RSD),RSD>5%需檢查操作或儀器狀態(tài)。
     
      四、日常維護與故障排查
     
      1.光源壽命管理:
     
      -氘燈壽命約1000小時,若能量下降或基線噪聲增大需更換。
     
      2.光學系統(tǒng)清潔:
     
      -定期用無水乙醇擦拭比色皿窗口,避免灰塵或樣品殘留。
     
      3.常見問題處理:
     
      -基線漂移:檢查電源穩(wěn)定性或光源老化。
     
      -噪聲過大:確認比色皿潔凈或狹縫寬度是否合適。

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